重复tDCS调节肥胖啮齿动物的微生物-肠-脑轴
微生物-肠-脑轴（The Brain-Gut-Microbiome Axis）：肠-脑轴是将大脑和肠道功能整合的双向信息交流系统，肠道微生物参与肠脑轴的功能反应，在肠道与大脑的信息交流中发挥着非常重要的作用，因此医学科学家们提出了“微生物-肠-脑轴”的概念。
Abstracts
背景： 大脑、肠道和脂肪组织之间的复杂相互作用使我们认识到肥胖是一种神经代谢紊乱。 最近的数据表明，肠道微生物群可能在肥胖发展中发挥潜在作用。 经颅直流电刺激（tDCS）是一种安全且无创的技术，可调节大脑皮层和其他连接大脑区域关于食欲控制的活动。
本研究的目的是评估前额叶皮层重复阳极tDCS（AtDCS）对高热量饮食（HCD）诱导肥胖大鼠的进食行为、代谢状态和肠道微生物群的选择门的影响。
方法：32只雌性Wistar大鼠根据饮食效应（瘦肉型与肥胖型）和刺激类型（主动型 && 假tDCS型 && 无刺激型）平均分为4个亚组。检查了饲料摄入量、体重、血液脂蛋白和瘦素水平以及肠道和粪便中的厚壁菌和拟杆菌。
结果：HCD改变了典型的肥胖相关范围的进食行为和代谢参数，并导致大肠和粪便中的类杆菌大量存在厚壁菌。AtDCS降低食欲、体重和胆固醇水平。此外，AtDCS降低了所有检查组织中厚壁菌平均数量与拟杆菌平均数量的比率。
结论： 重复的AtDCS不仅对食欲限制有效，还可以调节肠道微生物组组成，这证明了脑-肠道-微生物组轴的存在，并指出该技术是肥胖症的一种有前景的补充治疗。然而，这种效应应该在人体研究中进一步复制。
Introduction
肥胖现在被认为是一种脑部疾病，而不是一种简单的代谢紊乱，因为有记录表明大脑、肠道和脂肪组织之间存在多种相互作用。据推测，在肥胖中观察到的脑结构变化是由不同肥胖诱发的危险因素（如氧化应激、炎症、胰岛素抵抗和脂肪毒性）之间的协同作用引起的。
最近的数据，表明肥胖与肠道微生物群组成和功能特性的改变有关。人体肠道微生物群主要由两个优势菌门组成，厚壁菌门和拟杆菌门，占细菌群落总数的90%以上。正常的肠道微生物群负责宿主的整体健康，在营养和药物代谢、免疫调节和防止病原体定植方面发挥关键作用。临床和实验数据表明，与正常体重个体相比，肥胖人和动物的粪便微生物群表现出厚壁菌增加和类杆菌门减少，因此厚壁菌与类杆菌的比例增加。
目前的证据表明，大脑电活动的改变是许多神经精神障碍的背后原因。一种理论认为肥胖是大脑半球活动失衡的结果，右前额叶皮层（PFC）功能的降低可能导致暴饮暴食和缺乏活动，而大脑区域的过度激活可能会减少进食驱动力并促进活动。
本研究的目的是评估维持高热量饮食的大鼠的进食行为、代谢参数和肠道微生物群的选定门，并接受右侧PFC的重复AtDCS。在动物研究和人类研究中，右侧PFC的AtDCS被证明可以限制食物渴望,。因此，我们预计受到AtDCS的动物可能表现出食欲下降、肥胖相关代谢紊乱的改善以及肠道微生物组成的改变。
材料和方法
动物样本
该研究包括32只12-13周龄的雌性Wistar大鼠，平均基线体重为231±4 g。大鼠被关在塑料笼中（每个笼中两只），温度为21-25°C，湿度为55-65%，光暗周期为12-12小时。将大鼠随机分为标准食物颗粒（N=8）（脂肪8%，含灰分和矿物质的碳水化合物67%，蛋白质25%；能量2.75 kcal/g；波兰Kcynia Labofeed B） 或高热量饮食（HCD）（N=24），其脂肪含量比标准饲料高近三倍。在研究过程中（6周），两组动物都可以无限制地获得饲料和饮用水。
tDCS技术
实验设计： 在整个实验期间（42天），给大鼠喂食标准或高热量饮食（HCD）。在第一次刺激前5天（第29天），在两组老鼠中进行前额叶区域的颅外电极植入。主动刺激从研究的第34天开始，连续8天持续到第41天（每天两次a-10分钟刺激，电流强度为200µA）。每次连续刺激后24小时测量体重（BW，g）和采食量（FI，kcal），因此第一次测量在第35天进行，最后一次测量在研究第42天进行（BW2，FI2）。BW0表示研究开始时的初始体重，而BW1体重是在第一次刺激前（研究第34天）测量的。
在AtDCS期间，电流从颅外传导到背电极。在连续8天的清醒大鼠中进行刺激，在此期间，每只动物每天接受两次10分钟的活性（200µA）或假（0µB）AtDCS。在刺激期间，将大鼠置于单独的塑料笼中，并仔细监测其行为异常。
研究组和代谢参数
在颅外电极植入当天，肥胖大鼠根据应用的程序随机分为三个子组：
- Ob（N=8）-未暴露于刺激的完整HCD动物；
- Sh（N=8）-接受假ATDC的HCD动物；
- St（N=8）-接受HCD的动物，受到右侧PFC的活性AtDCS。
与接受标准食物饮食的瘦完整大鼠（L；N=8）一起，创建了四个亚组。
在首次应用AtDCS的当天，记录试验组的以下平均体重：Ob-291±4 g、Sh-289±4 g，St-290±6 g和L-276±4 g。
在整个研究过程中记录饮食摄入量和体重。
- 每日饲料摄入量（dFI g/24小时）计算为提供的饮食和从笼子收集的剩余食物之间的差异除以两次连续测量之间的天数。每只老鼠的kcal摄入量
- 平均累积饲料消耗量dFI （kcal/24 h）
- 平均每日体重增加（dBWG，g/24小时）
- 体重增加的具体速率（sBWG；g/kg）
在实验结束时（研究的42天），最后第8次刺激后24小时，将所有大鼠断头，并在无菌条件下收集小（空肠）和大（结肠）肠以及粪便和其他组织的血液样本，以供进一步检查。
肠道微生物群的选定门的评估
肠道样本和粪便
使用Genomic Mini提取小肠和大肠以及粪便样本的细菌DNA。获得的DNA模板用于定量PCR实时扩增（qPCR）以估计厚壁菌门和拟杆菌门的数量。
实时定量PCR（看不懂）
使用以下针对拟杆菌和厚壁菌的特异引物进行扩增程序。为了确定拟杆菌（5′-AACGGCTACAGG CTT-3′）和（5′-CAATCGGGTTCTCTGTG-3′）（寡核苷酸序列），使用了厚壁菌（5′GCGTGAGTGAGAAGT-3’）和（5’-CTACGCTCCT TTACAC-3′）。分别为这些细菌组制备10µL反应混合物：5µL SYBR Green PCR主混合物（A&A生物技术）；0.1μL浓度的特异引物对（基因组）和2μL模板。使用以下PCR条件：在95°C下初始变性5分钟，然后进行40个循环，包括变性（95°C 30秒）、退火（类杆菌47°C，厚壁菌引物44°C；30秒）和延伸（72°C 30 s）。在CFX96热循环仪（BioRad）中对每个样品进行PCR扩增，一式两份。通过将Cq（定量循环）值与标准曲线进行比较来计算细菌数量。将脆弱类杆菌ATCC 25285（类杆菌）和粪肠球菌ATCC 29212（厚壁菌）的DNA分别以对应于101–107个细胞的系列稀释液添加到一系列QPCR中。为了确定类杆菌和普氏杆菌细胞的数量，在测定的线性范围内对DNA样品（一式两份）中检测到的荧光信号进行平均，并与标准曲线进行比较。将获得的数据转换为1g组织。
计算和统计
数据分布（正态或非正态）由Shapiro–Wilk检验确定。因此，所有结果均以平均值（±SD）或中位数（以及第25-75百分位）表示。在数据子组的正态分布和等方差的情况下，使用参数双向方差分析（ANOVA），然后使用Bonferroni事后检验。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Bonferroni事后检验对不符合正态性或等方差标准的数据进行分析。为了比较不同时间点的体重（BW，g），使用重复测量方差分析（ANOVA），将“时间”作为受试者内因素，将“组”作为受检者间因素，然后在适当时进行Bonferroni事后检验。为了研究两组之间的时间效应是否不同，我们确认了“时间”与“群体”互动。进行球度的Mauchly试验，必要时进行温室-盖瑟校正。皮尔逊或斯皮尔曼相关用于证明有或无正态数据分布的检查参数之间的关系。样本的相关系数根据Guilford的解释进行分类。当p<0.05时，数据被认为具有统计学意义。
结果
摄食行为和代谢参数
A 实验开始时（BW0）、第一次刺激前（BW1）和最后一次刺激后24小时（BW2）组内的平均体重[g]。双向方差分析和重复测量方差分析，然后进行Bonferroni事后检验。数据显示为平均值±标准差。
B 研究结束时血清总胆固醇（TCh）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白和甘油三酯（Tg）的浓度[mmol/L]。双向方差分析（TCh）或Kruskal-Wallis检验（LDL、HDL、Tg），然后进行Bonferroni事后检验。数据显示为平均值±标准差。
L-贫瘦的完整个体（N=8）；Ob-肥胖的完整完整个体（N=8）；Sh-肥胖假刺激个体（N=8）；St-肥胖主动刺激个体（N=8）。
A 刺激前（dBWG1）和B 刺激期（dBWG2）组内的平均每日体重增加[g/24 h]。
C 刺激前（dFI1）和D 刺激期（dFI2）内的平均日采食量[kcal/24 h]。
Kruskal–Wallis测试，随后是Bonferroni事后测试。
A 刺激前阶段（cFI1）、B 刺激期（cFI2）、C 整个研究期间（cFI）的累积采食量[kcal]：
A 刺激前（sBWG1）、B 刺激期（sBWG2）、C 整个研究（sBWG）的特定体重增加率[g/kg]以及D 研究结束时的血清瘦素浓度[pg/mL]。
实验结束时体重（BW2）与以下因素之间的高皮尔逊（rP）或斯皮尔曼（rS）相关性：A 血清总胆固醇（TCh）和B 瘦素浓度、C 刺激期的日采食量（dFI2）、D 刺激期的累积采食量，以及刺激期的每日体重增加（dBWG2）与整个实验的累积采食量（cFI）和刺激期的F每日采食量之间的关系。TCh和瘦素浓度都是在研究结束时测量得到。
高（皮尔逊（rP）或斯皮尔曼（rS）相关性：A 刺激期体重增长率（sBWG2）和刺激期累积采食量（cFI2）、B 整个实验体重增长率比sBWG和刺激期累计采食量，C 整个实验的体重增加率（sBWG）和血清总胆固醇浓度（TCh），D 刺激期的血清总胆固醇（TCh）浓度和日采食量（dFI2），E 刺激期血清总胆固醇的浓度（TCC）和累积采食量，F 血清总胆固醇（TCh）浓度和低密度脂蛋白（LDL）浓度。TCh和瘦素浓度都是在研究结束时测量得到。
A 整个实验中的体重增长率（sBWG）和刺激期的日采食量（dFI2）、刺激期的体重增长比率, B（sBWG2）和刺激期间的日采食量（DFII）之间，C 在整个实验中体重增加的比速率（sBWG）和粪便中厚壁菌与拟杆菌的平均数量的比率（粪便F/B比率）、D刺激期的每日体重增加（dBWG2）和粪便中厚壁菌的平均数量与拟杆菌平均数量的比（粪便F/B比率），E研究结束时瘦素（瘦素）浓度和第一次刺激前体重（BW1）的高相关性
正如预期的那样，在刺激前近5周的时间内，L组大鼠消耗的热量少于特定饮食中脂肪含量较高的动物，因为两组之间的平均日采食量（dFI1，kcal/24h）和累积采食量显著不同。（Figs. 3C, 4A）
dFI1的增加伴随着更高的每日体重增加（dBWG1，g/24小时），表明过量饮食是我们大鼠肥胖的主要原因。在预刺激期，HCD小组之间的体重和采食量没有差异（Figs. 2A, 3A, C）
- 连续8天施用AtDCS改变了采食量和体重，导致每日采食量（dFI2）减少，因此累积采食量（cFI2）以及每日体重（dBWG2）增加（图3B，D，4B）
- 各组中计算的BWG比率（sBWG）进一步强调了HCD和AtDCS对体重的影响（Fig. 5A-C）
- HCD的消耗增加了血清瘦素（图5D）、TCh和LDL水平（图2B），但未改变研究结束时测得的HDL或Tg。血清瘦素浓度不因使用的刺激程序而有所不同。AtDCS改善了血清脂蛋白，导致TCh和HDL显著降低，而对LDL或Tg无影响（图2B）。St和Sh之间以及完整动物（L和Ob）和Sh之间的TCh差异显著。高密度脂蛋白水平在St和Sh之间存在显著差异，与完整动物（L和Ob）相比，St中的HDL水平有降低的趋势。假刺激对血清HDL水平没有影响。通过分析饮食和刺激程序对TCh的可能相互作用，双向方差分析表明，个体变量的影响是加性的，即相互独立。
- 在我们的测试组中检测到行为和代谢参数之间的若干强相关性（图6、7、8）。BW2与dFI2和cFI2以及血清瘦素和TCh高度正相关（图6）。检测到dBWG2与dFI2或cFI2之间非常高的正相关（图6）。此外，sBWG和sBWG2与dFI2和cFI2高度正相关（图7、8），而sBWG也与TCh相关（图6）。此外，dFI2，因此cFI2与TCh高度正相关（图7）。TCh和LDL之间以及LDL和cFI2之间的非常高的关系在图1和图2中示出。7和8。
肠道微生物群的选定门的评估
小肠中厚壁菌的平均数量和类杆菌的平均数量（分别为A和D）；大肠中的平均厚壁菌数和平均拟杆菌数（分别为B和E）以及粪便中的平均厚壁菌数和平均类杆菌数（分别为C和F）。
CFU菌落形成单位，Colony Forming Unit。
小肠（A）和大肠（B）以及粪便（C）中厚壁菌平均数量与拟杆菌平均数量的比率（F/B比率）。
在我们大鼠的大肠和粪便中观察到HCD应用后微生物群组成的最显著变化。高脂肪饮食摄入导致粪便中厚壁菌数量增加（图9C），导致粪便F/B比更大（图10C）。HCD还显著增加了大肠的F/B比率（图10B）。
右侧PFC的AtDCS改变了肠道和粪便主要门的数量，导致小肠、大肠和粪便的F/B比率降低（图10A-C）。使用Bonferroni校正的事后成对比较显示，St和Sh之间的小肠F/B比率或St和完整动物（L和Ob）之间、St和Sh的大肠F/B比例以及St和Sh间的粪便F/B比存在显著差异。在所有检查组织中，未检测到完整（L和Ob）和假刺激动物之间的微生物群组成有显著差异（图9）。粪便F/B比率与sBWG或dBWG2之间的关系非常高（图8D）。
Discussion
我们研究的新发现是，正确PFC的重复AtDCS不仅在改善肥胖相关的进食行为和代谢紊乱方面有效，而且在高热量饮食大鼠的肠道微生物群组成方面也有效。这些结果证明了大脑和肠道之间存在复杂的神经、代谢、免疫和其他连接网络， 称为脑-肠-微生物群轴。
我们之前证明，当前实验中应用的刺激方案是安全有效的，没有发现任何大脑异常的宏观或微观证据。此外，受刺激的动物没有表现出行为异常或不适迹象。此外，tDCS的参数（电流强度、刺激周期的持续时间和数量、有源电极和反电极的直径和位置）显示为无害。一些研究指出右半球是食欲控制的关键区域。右额叶受损可导致贪食症和对精细食物的特定偏好，而该大脑区域的过度活跃，如癫痫患者，可导致类似厌食症的症状。此外，在退行性痴呆患者中，贪食症的存在与右额叶萎缩呈正相关，肥胖个体在运动和认知任务中表现出减少的右半球偏好。另一方面，一些数据表明，左侧或双侧PFC刺激也会降低女性的食物渴望。
在本研究中，我们已经表明HCD和AtDCS都会影响雌性Wistar大鼠的进食行为、代谢参数以及肠道微生物群的主要门。
刺激前五周的HCD显著增加了每日和累积饲料摄入量，导致特定饮食的大鼠体重增加，与瘦肉大鼠相比。这些结果表明，在我们的大鼠中，热量消耗增加是肥胖的主要原因，并且与普遍接受的观点一致，即肥胖是由能量供应增加引起的。除St外，所有组在刺激前和刺激期间的平均摄食量均无差异，表明右侧PFC的AtDCS是限制肥胖大鼠食欲的有效工具。事实上，只有具有AtDCS的大鼠在刺激期间以及在比较刺激前（dFI1）和刺激时间（dFI2）时，改变了其进食行为，消耗的热量低于其他大鼠。此外，AtDCS诱导的热量摄入抑制伴随着体重增加率的降低，表明饲料消耗减少是我们大鼠体重下降的主要原因。我们的结果与数据一致，数据表明，正确PFC的AtDCS能够限制动物和人类的食物渴望。 此外，研究表明，即使一次背外侧额叶皮质tDCS也能有效降低食物渴求。正如预期一样，HCD应用增加了血清瘦素水平，其与最终体重（BW2）高度正相关（图6）。我们的结果证明了通常观察到的发现，即血清瘦素水平与人体和动物的体重指数和身体肥胖呈正相关，因为白色脂肪组织是瘦素的主要来源。
HCD和肥胖降低了大鼠的血脂水平，因为TCh和LDL与对照水平相比增加。有趣的是，与假刺激和完整大鼠相比，AtDCS应用改善了TCh和HDL，但不改善LDL或Tg浓度，导致TCh和高密度脂蛋白水平显著降低。这些观察表明，血清HDL的变化不依赖于饮食，而是依赖于刺激程序。与HDL相反，TCh和LDL与最终体重（BW2）、体重增加（sBWG）、每日（dFI）和累积饲料摄入量（cFI）以及瘦素水平正相关，表明肥胖相关行为和代谢参数之间的因果关系。
最后，我们的结果表明，不仅HCD而且AtDCS的应用影响肠道微生物群的选定门，并且这些变化与行为和代谢参数的变化相关。最近的研究表明，由于能量平衡受损，肠道微生物群的组成和多样性发生改变，可能在神经精神疾病和代谢紊乱（如肥胖）的发展中发挥重要作用。肠道微生物群发挥了许多生理作用，涉及消化、代谢、营养素的提取、维生素的合成，预防病原体定植和免疫调节。主要细菌门有：厚壁菌（革兰氏阳性）、类杆菌（革兰阴性）和放线菌（革兰阳性）。饮食、疾病、药物、压力和环境可能会暂时改变肠道微生物群组成。
人类研究的数据与动物模型的结果基本一致，表明肥胖受试者大肠中的拟杆菌和厚壁菌数量低于瘦肉对照组。肥胖受试者的F/B比率明显较高，其值是正常体重患者的两倍以上。此外，类杆菌的丰度随着肥胖人群的体重减轻而增加，而厚壁菌门，尤其是它们的一些属，如乳杆菌和梭菌，与肥胖相关的代谢失调有关。将AtDCS应用于我们的肥胖大鼠会影响受试组织中被检测门的数量。尽管AtDCS不相关地改变了拟杆菌和厚壁菌的平均数量，但与假刺激相比，它导致F/B比显著降低。该观察表明，AtDCS能够逆转HCD和肥胖对肠道微生物群的不利影响。AtDCS诱导的主要微生物群落向对照水平的改善表明，这种非侵入性技术是调节肥胖受试者肠道微生物群落含量的有效工具。此外，研究结果支持了大脑和肠道之间存在复杂双向通信的假设，即脑-肠-微生物群轴。几种途径，包括迷走神经、免疫和内分泌系统以及肠道神经系统，介导大脑和肠道微生物群之间的双向通信。
结论
我们得出结论，右PFC的ATDC能够调节HCD肥胖大鼠的进食行为、代谢参数和肠道微生物组成。这些发现证明了脑和肠道之间存在双向沟通，即脑-肠-微生物群轴，并强调了微生物群组成在肥胖发病机制中的作用。此外，我们的结果指出，tDCS是一种有前景的、无创的肥胖症辅助治疗方法，尽管所获得的行为和代谢效应以及AtDCS应用的最佳刺激方案应在人体研究中进一步研究和复制。
